ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И

СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ

Санитарная микробиология

Учебное пособие

Для студентов медицинских вузов

Казань 2011

УДК 579.63:614.(075.8)

ББК 51.201.7я73

Печатается по решению Центрального координационно-методического совета Казанского государственного медицинского университета

Составители - сотрудники кафедры микробиологии:

профессор О.К.Поздеев, профессор Л.Т.Мусина, доцент А.Н.Савинова,

доцент Е.Р.Федорова, доцент Г.Ш.Исаева, ст. преподаватель С.Б.Богданова,

ассистент Ю.В.Валеева

Рецензенты:

Доцент кафедры микробиологии Казанской государственной медицинской

академии к.б.н. Л.В. Кипенская

Доцент кафедры эпидемиологии Казанского государственного медицинского университета к.м.н. Н.М. Хакимов

Санитарная микробиология. Учебное пособие для студентов медицинских вузов/ О.К.Поздеев, Л.Т.Мусина, А.Н.Савинова, Е.Р.Федорова, Г.Ш.Исаева, С.Б.Богданова, Ю.В.Валеева - Казань: КГМУ, 2011 - 101 с.

Учебное пособие предназначено студентам медицинских вузов для самостоятельного изучения основных разделов санитарной микробиологии. Пособие составлено в соответствии с официально утвержденными программами преподавания микробиологии в медицинских вузах и документами, регламентирующими исследования по санитарной микробиологии. В пособии учтены современные нормативные документы по исследованию воды, воздуха, почвы, пищевых продуктов и ЛПО. Пособие содержит методики санитарно-микробиологического контроля различных объектов, цели и задачи лабораторных занятий, направленных на освоение общекультурных и профессиональных компетенций, учебные карты занятий, вопросы для самоподготовки и самоконтроля, ситуационные задачи и тесты.

Казанский государственный медицинский университет, 2011

1. Список сокращений…………………………………………………………… 4

2. Вводные представления…………………………………………………………5

3. Микрофлора воды………………………………………………………………..9

4. Санитарно-микробиологическое исследование питьевой воды централизованного водоснабжения………………………………….…………11

5. Выявление Legionella pneumophila в объектах окружающей среды………...17

6. Микрофлора воздуха……………………………………………………………..23

7. Санитарно-микробиологическое исследование воздуха в

лечебно-профилактических организациях (ЛПО)……………...……………...25

8. Микрофлора почвы………………………………………………………………30

9. Санитарно-микробиологическое исследование почвы………………………..32

10. Санитарно-микробиологическое исследование пищевых продуктов………...39

11. Основные методы определения санитарно-показательных микробов в

пищевых продуктах ………………………………………………………………40

12. Микрофлора молока и молочных продуктов……………………………………41

13. Микрофлора мяса и мясных продуктов………………………………………….47

14. Исследование мяса……………………………………………………………...... 47

15. Санитарно-микробиологическое исследование полуфабрикатов и готовых

изделий из рубленого мяса………………………………………………………..49

16. Санитарно-микробиологическое исследование колбасных изделий и

продуктов из мяса…………………………………………………………………49

17. Санитарно-микробиологическое исследование рыбы…………………………50

18. Санитарно-микробиологическое исследование напитков……………………..51

19. Санитарно-микробиологическое исследование консервов……………………52

20. Санитарно-микробиологические исследования в лечебно-профилактических

организациях (ЛПО)……………………………………………..……………..…58

21. Санитарно-микробиологические исследования в стационарах

(отделениях) хирургического профиля………….……………………………….58

22. Санитарно-микробиологические исследования в стационарах (отделениях)

акушерского профиля и перинатальных центров………………………………59

23. Санитарно-микробиологические требования к стоматологическим

медицинским организациям……………………………………………………..60

24. Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и

эксплуатации фельдшерско-акушерских пунктов (ФАП)……………………..61

25. Лабораторные исследования в ЛПО…………………………………………….61

26. Микробиологический контроль аптек…………………………………………..67

27. Тесты по санитарной микробиологии…………………………………………..83

28. Список литературы……………………………………………………………….100

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БГКП - бактерии группы кишечной палочки

БОЕ - бляшкообразующие единицы

ГОБ - грамотрицательные бактерии

ГОСТ - государственный стандарт

ГПС - глюкозо-пептонная среда

ЖСА - желточно-солевой агар

ЖСТ - желточная среда Турчинского

КМАФАМ - количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных

микроорганизмов

КОЕ - колониеобразующие единицы

ЛПО - лечебно-профилактические организации

ЛПС - лактозо-пептонная среда

МАФАМ - мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные

микроорганизмы

МАФАнМ - мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные

микроорганизмы

МЖСА - молочно-желточно-солевой агар

МИС - молочно-ингибиторная среда

МКТ - Мюллера-Кауфмана тетратионатный бульон

МПА - мясо-пептонный агар

МПБ - мясо-пептонный бульон

МСА - молочно-солевой агар

МУК - методические указания

ОКБ - общие колиформные бактерии

ОМЧ - общее микробное число

ПБЛ - питательный бульон для листерий

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РА - реакция агглютинации

СанПиН - санитарные правила и нормативы

СП - санитарные правила

СПМ - санитарно-показательные микроорганизмы

ТКБ - термотолерантные колиформные бактерии

ТР - технический регламент

УФ - ультрафиолетовые лучи

ЦРБ - Центральная районная больница

ЩЭС - щелочная элективная среда с полимиксином

XLD - ксилоза-лизин декстрозный агар

RVS - среда Раппопорта-Вессилиадиса с соей

ВВОДНЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ

Санитарная микробиология - направление медицинской микробиологии, изучающее микрофлору окружающей среды и её влияние на здоровье человека и состояние среды его обитания. Началом развития санитарной микробиологии можно считать 1883 г., когда французский врач Э. Масе предложил рассматривать кишечную палочку как показатель фекального загрязнения воды. Изучение микрофлоры и микробиологических процессов в среде обитания человека необходимо для гигиенической оценки его взаимоотношений с окружающей средой.

Знания, умения и навыки, полученные при изучении санитарной микробиологии, способствуют выработке таких общекультурных и профессиональных компетенций, как:

1. Способность и готовность анализировать социально-значимые проблемы и процессы, использовать на практике методы гуманитарных, естественнонаучных, медико-биологических и клинических наук в различных видах профессиональной и социальной деятельности (ОК -1)

3. Способность и готовность применять методы асептики и антисептики, использовать медицинский инструментарий, проводить санитарную обработку лечебных и диагностических помещений медицинских организаций (ПК-7).

4.Способность и готовность использовать нормативную документацию, принятую в здравоохранении (законы Российской Федерации, технические регламенты, международные и национальные стандарты, приказы, рекомендации, терминологию, международные системы единиц (СИ), действующие международные классификации), а также документацию для оценки качества и эффективности работы медицинских организаций (ПК-27).

Основные задачи санитарной микробиологии:

1. Изучение микробных биоценозов во внешней среде

2. Обнаружение во внешней среде патогенных микробов или их токсинов.

3. Обнаружение во внешней среде условно-патогенных микроорганизмов, являющихся косвенными показателями загрязнения изучаемых объектов патогенными микробами.

4. Выявление во внешней среде микроорганизмов, являющихся причиной порчи пищевых продуктов, сырья, строительных материалов.

5. Выработка нормативов, характеризующих гигиеническое состояние объектов внешней среды.

Санитарно – микробиологические исследования проводят:

1. При проведении текущего санитарного надзора

2. При решении вопросов о возможных источниках и путях передачи возбудителей инфекционных заболеваний.

3. При проектировании и выборе места для строительства зданий, населенных пунктов и сельскохозяйственных объектов.

4. При решении вопросов водоснабжения, канализации и обеззараживания отбросов.

Стандартные методы санитарно-микробиологических исследований регламентированы ГОСТами, санитарными правилами (СП), санитарными правилами и нормами (СанПиН) и методическими указаниями (МУК) и техническими регламентами (ТР).

Принципы проведения санитарно-микробиологических исследований.

1. Пробы для исследований следует отбирать с соблюдением всех необходимых условий, регламентированных для каждого исследуемого объекта. Исследования необходимо проводить быстро; при невозможности немедленного проведения анализа материал сохраняют в холодильнике не дольше 6-8 часов.

2. Для получения объективных результатов следует отбирать несколько проб из разных участков объекта.

3. Более адекватные результаты можно получить проведением повторных отборов и анализов проб.

4. При проведении анализов следует использовать только стандартные и унифицированные методы исследования.

5. Интерпретацию результатов санитарно-микробиологических исследований следует проводить с учетом других гигиенических показателей (органолептических, химических, физических).

Применяют 2 основных метода оценки санитарно-гигиенического состояния внешней среды:

1. Прямое обнаружение патогенных микроорганизмов

2. Появление косвенных признаков пребывания патогенных микроорганизмов во внешней среде.

Методы косвенной индикации применяют чаще.

При проведении исследований используют два критерия, по которым можно косвенно судить о возможном присутствии возбудителя во внешней среде: общее микробное число (ОМЧ ) и содержание санитарно-показательных микроорганизмов (СПМ ).

ОМЧ определяют путем подсчета всех микроорганизмов (растущих на питательных средах) в 1 г или 1 мл субстрата.

Санитарно-показательные микроорганизмы (СПМ ) - условно-патогенные микробы, являющиеся облигатными представителями нормальной микрофлоры человека и животных, обнаружение которых во внешней среде свидетельствует о фекальном или воздушно-капельном загрязнении ее выделениями человека.

Основные характеристики СПМ.

1. СПМ должны постоянно обитать в естественных полостях человека и животных и постоянно выделяться во внешнюю среду.

2. СПМ не должны размножаться во внешней среде (исключая пищевые продукты)

3. Длительность выживания СПМ должна быть несколько больше, чем у патогенных микроорганизмов.

4. Устойчивость СПМ во внешней среде должна быть не меньше, чем у патогенных микроорганизмов.

5. У СПМ не должно быть во внешней среде аналогов, с которыми их можно перепутать.

6. СПМ не должны изменяться во внешней среде.

7. Методы идентификации СПМ должны быть простыми.

1. Прямой подсчет числа бактерий с помощью специальных камер счетчиков.

2. Посев на питательные среды.

Титр СПМ - наименьший объем исследуемого материала или минимальное количество субстрата, в котором обнаружена хотя бы одна особь СПМ.

Индекс СПМ - количество особей СПМ, обнаруженных в определенном объеме или определенном количестве исследуемого материала

Перевод индекса в титр и обратно производится делением 1000 на число выражающее индекс, или 1000 на число, обозначающее титр.

НВЧ (наиболее вероятное число) - вероятная оценка числа СПМ в определенном объеме воды или в определенном объеме другого субстрата. Этот показатель имеет доверительные интервалы, в пределах которых может колебаться с вероятностью 95%.

Все СПМ расценивают как индикаторы биологического загрязнения.

Группа А - индикаторы фекального загрязнения - включает обитателей кишечника человека и животных. Это бактерии группы кишечной палочки (БГКП)- эшерихии, сальмонеллы, цитробактерии. Группа А включает также энтерококки, протей, сульфитвосстанавливающие клостридии (Clostridium рerfringens и др.), термофилы, бактериофаги, бактероиды, синегнойную палочку, кандиды и аэромонады.

Группа В - индикаторы орального загрязнения. Включает обитателей верхних дыхательных путей и носоглотки. Это зеленящие α и β-гемолитические стрептококки, стафилококки (гемолизирующие, плазмокоагулирующие, лецитиназа-положительные и антибиотикоустойчивые), в некоторых случаях также определяют вид золотистого стафилококка.

Группа С - индикаторы процессов самоочищения – сапрофитические микроорганизмы, обитающие во внешней среде. К ним относят бактерии-протеолиты, бактерии-аммонификаторы и нитрификаторы, некоторые спорообразующие бактерии, грибы, актиномицеты, целлюлозобактерии, бделловибрионы и сине-зеленые водоросли.

К основным СПМ относят БГКП, энтерококки, протеи, сальмонеллы, Clostridium perfringens , термофильные бактерии и бактериофаги энтеробактерий (колифаги).

(предусматривают определение общей микробной обсеменённости (ОМЧ), определение и титрование санитарно-показательных микроорганизмов).

Санитарно-микробиологическое состояние почвы оценивается на основании сопоставления количества термофильных бактерий и бакте-
рий – показателей фекального загрязнения. Почвы с преобладанием санитарно-показательных бактерий расцениваются как санитарно-неблагополучные, загрязнённые фекалиями человека или животных. Присутствие в почве E. coli и Enterococcus faecalis указывает на свежее (до 2 недель), бактерий родов Citrobacter и Enterobacter – на несвежее (до 2 месяцев), а Clostridium perfringens – на давнее (более 2 месяцев) фекальное загрязнение. Более точная оценка проводится с помощью определения коли-индекса – количество бактерий группы кишечной палочки (БГКП), обнаруженных в 1 г почвы, перфрингенс-титра – масса почвы (в граммах), в которой обнаружена 1 особь Clostridium perfringens, общего числа сапрофитных, термофильных и нитрифицирующих бактерий в 1 г почвы.

Микробиологические нормативы для оценки санитарного состояния почвы:

– чистая почва: коли-титр – 1 и выше; перфрингенс-титр – 0,01 и выше; ОМЧ – 100-1000;

– загрязнённая почва: коли-титр – 0,9-0,01; перфрингенс-титр – 0,009-0,0001; ОМЧ – 1000-100000;

– сильно загрязнённая почва: коли-титр – 0,009 и ниже; перфрингенс-титр – 0,00009 и ниже; ОМЧ – 10000-4000000.

Для определения ОМЧ почву берут на глубине 10-15 см стерильным ножом (из разных мест не менее 10 проб) в стерильную банку. Из проб готовят навеску 30 г, которую вносят в колбу с водой (270 мл) и тщательно встряхивают. Готовят разведения 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 . Из 2-х последних разведений 0,1 мл смешивают с 40 мл 0,7% расплавленного и остуженного до 45 0 С МПА, после чего выливают двойным слоем в чашки с 2% агаром. Инкубируют в термостате. Подсчитывают количество выросших колоний.

Для определения коли-титра, перфрингенс-титра различные разведения почвенной суспензии засевают по 1 мл в пробирки со средой Кесслера. Инкубируют при 43 0 С 48 часов. При получении в средах газообразования и помутнения производят высев петлей на среду Эндо. Отбирают типичные для кишечной палочки колонии, делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. При выявлении в мазках грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу. Если проба отрицательная, проверяют ферментативные свойства выделенной культуры посевом на полужидкую среду с глюкозой. Появление в среде кислоты и газа подтверждает наличие E. coli. Определяют коли-титр по наименьшему объёму, в котором обнаруживают БГКП.

Для определения перфрингенс-титра различные разведения почвенной суспензии засевают в пробирки со стерильной железосульфитной средой Вильсон-Блера. После 48 часов инкубации при 43 0 С учитывают результаты по образованию черных колоний C. perfringens в агаровом столбике среды. Мазки окрашивают по Граму, микроскопируют (крупные грамположительные палочки со спорами овальной формы, центрального или субтерминального расположения), вычисляют перфрингенс-титр (наибольшее разведение посевного материала, посев которого приводит к почернению и разрыву среды в первые 12 часов роста при 43 0 С).

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования

«ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» (ПГУ)

Основы санитарной микробиологии

Учебно-методическое пособие для студентов медицинских вузов

Методическое пособие подготовлено на кафедре микробиологии, эпидемиологии и инфекционных болезней медицинского института ПГУ.

Пособие составлено в соответствии с программой по микробиологии, вирусологии для студентов медицинских вузов.

Изложены задачи и методы санитарной микробиологии. Приведены методы санитарно-микробиологического обследования объектов, актуальных в плане возникновения и распространения инфекций

Список сокращений. 4

1. Задачи санитарной микробиологии. 5

2. Методы санитарной микробиологии. 6

2.1. Понятие о санитарно-показательных микроорганизмах. 7

2.2. Характеристика основных групп СПМ.. 9

2.3. Косвенные показатели загрязнения. 11

3. Принципы санитарно-микробиологических исследований. 14

4. Санитарно-микробиологическое исследование воздуха. 16

4.1. Микрофлора воздуха. 16

4.2. Исследование воздуха. 18

5. Санитарно-микробиологическое исследование воды. 27

5.1. Микрофлора воды. 27

5.2. Исследование воды.. 28

6. Санитарно-микробиологическое исследование почвы. 52

6.1. Микрофлора почвы. 52

6.2. Исследование почвы. 54

7. Санитарный режим лечебно-профилактических учреждений. 60

7.1. Организация дезинфекционных и стерилизационных мероприятий в лечебно-профилактических организациях (ЛПО). 62

7.2. Санитарно-микробиологическое исследование оборудования, рук и спецодежды персонала. 85

7.3. Санитарно-бактериологическое исследование перевязочного, шовного и другого хирургического материала. 87

7.4. Исследование на носительство золотистого стафилококка. 88

8. Санитарно-микробиологическое исследование пищевых продуктов. 89

8.1. Микрофлора пищевых продуктов. 89

8.2. Исследование пищевых продуктов. 90

8.3. Санитарно микробиологическое исследование молока и молочных продуктов 96

Список литературы. 103

Список сокращений

СПМ - санитарно-показательные микроорганизмы

БГКП - бактерии группы кишечной палочки

ВБИ - внутрибольничные инфекции

КМАФАМ – количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

КОЕ - колониеобразующие единицы

ЛПО – лечебно-профилактические организации

ЛПУ – лечебно-профилактические учреждения

ЛКП - лактозоположительные кишечные палочки

ОМЧ – общее микробное число

МАФАМ или МАФАнМ – мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы

МПА – мясо-пептонный агар

ОЧС – общее число сапрофитов

ТКБ - термотолерантные колиформные бактерии

1. Задачи санитарной микробиологии.

Санитарная микробиология – медико-биологическая наука, исследующая закономерности существования потенциально опасных для человека микроорганизмов в окружающей среде и обусловливаемые ими процессы, которые могут непосредственно или косвенно оказывать вредное влияние на здоровье людей.

Санитарная микробиология относится к группе профилактических наук и находится на стыке микробиологии, гигиены и эпидемиологии.

Объектами изучения санитарной микробиологии являются:

· потенциально патогенные и санитарно-показательные микроорганизмы внешней среды,

· физические, химические и биологические факторы внешней среды, способствующие или препятствующие существованию этих групп микроорганизмов во внешней среде и их проникновению в организм человека.

Важнейшими задачами санитарной микробиологии являются:

1) изучение закономерностей взаимообмена (круговорота) потенциально опасных для человека микробов между микропопуляциями людей, животных и совокупностью объектов окружающей среды, включая условия существования микробов в этих трех средах;

2) поиск и использование микробиологических методов оценки безопасности для человека пищевых продуктов, воды, воздуха и разнообразных предметов и материалов;

3) разработка нормативов, устанавливающих соответствие качественного и количественного состава микрофлоры конкретных объектов внешней среды гигиеническим требованиям;

4) оценка путей воздействия человека и животных на окружающую среду. В результате промышленной и индивидуальной деятельности людей происходит контаминация объектов окружающей среды патогенными микроорганизмами, при этом особое внимание уделяется изучению нарушений процессов самоочищения воды, почвы;

2. Методы санитарной микробиологии

Методы, используемые в санитарной микробиологии, можно разделить на 2 группы: прямые и косвенные.

Прямые методы предполагают непосредственное обнаружение возбудителей инфекционных болезней или их токсинов в объектах окружающей среды.

Для определения патогенных микроорганизмов могут быть использованы следующие методы:

Прямой посев исследуемого материала на питательные среды;

Предварительная концентрация патогенных микроорганизмов пропусканием исследуемого объекта (жидкой консистенции) через мембранные фильтры или посевом в среды накопления;

Обнаружение патогенных микроорганизмов методом заражения чувствительных животных (биопроба);

Применение ускоренных методов: серологических, иммунолюминисцентного и радиоиммунного анализов.

Методы прямого обнаружения - наиболее точные и надёжные критерии оценки эпидемиологической опасности внешней среды. Несмотря на то, что в настоящее время разработаны методы прямого, ускоренного и количественного определения потенциально патогенных микробов, данный метод имеет целый ряд недостатков. К ним относятся следующие:

· патогенные микроорганизмы находятся в окружающей среде непостоянно - сравнительно легко их можно обнаружить в период эпидемии той или иной инфекции, но очень трудно - в межэпидемические периоды. Основная же деятельность санитарных микробиологов направлена на предупреждение возникновения эпидемий и поэтому вся работа ведется в межэпидемические периоды;

· концентрация патогенных микроорганизмов в окружающей среде значительно уступает непатогенным и распространение их в объектах неравномерно;

· при выделении патогенных микроорганизмов методами культивирования на питательные среды, даже ингибиторные, они неизбежно страдают от конкуренции сапрофитной флоры.

В связи с вышеизложенным получаемые отрицательные результаты прямого определения патогенных микроорганизмов в объектах окружающей среды еще не говорят с достоверностью об их отсутствии.

Косвенные методы предполагают определение общего числа микробов и обнаружение санитарно-показательных микроорганизмов (СПМ).

2.1. Понятие о санитарно-показательных микроорганизмах

Микроорганизмы, обитающие в кишечнике или в верхнем отделе дыхательных путей человека и животных и постоянно выделяющиеся окружающую среду, называются санитарно - показательными .

По количеству СПМ можно косвенно судить о возможном присутствии патогенов во внешней среде. То есть при их определении исходят из предположения, что чем больше объект загрязнен выделениями человека и животных, тем больше будет СПМ и тем вероятнее присутствие патогенов.

Основные требования, предъявляемые к санитарно-показательным микроорганизмам, следующие:

1) постоянное обитание в естественных полостях организма человека и животных (которые являются их единственной природной средой обитания - биотопом) и выделение их в большом количестве в окружающую среду;

2) продолжительность выживания их в окружающей среде должна быть такой же или большей, чем патогенных микроорганизмов, выводимых из организма теми же путями;

3) не должны размножаться в окружающей среде;

4) не должны сколько-нибудь значительно изменять свои биологические свойства при попадании в окружающую среду;

5) должны быть достаточно типичными, с тем, чтобы их дифференциальная диагностика осуществлялась без особого труда;

6) индикация, идентификация и количественный учет должны производиться современными, простыми, легко доступными и экономичными микробиологическими методами.

Все санитарно-показательные микроорганизмы являются индикаторами биологического загрязнения. Выделяют несколько групп микроорганизмов, обнаружение которых в объектах окружающей среды говорит о различных видах загрязнения. Но между группами СПМ нет четких границ, так как некоторые микроорганизмы являются показателями различных видов загрязнения.

Микробиологические нормативы для оценки санитарного состояния почвы:

– чистая почва: коли-титр – 1 и выше; перфрингенс-титр – 0,01 и выше; ОМЧ – 100-1000;

– загрязнённая почва: коли-титр – 0,9-0,01; перфрингенс-титр – 0,009-0,0001; ОМЧ – 1000-100000;

– сильно загрязнённая почва: коли-титр – 0,009 и ниже; перфрингенс-титр – 0,00009 и ниже; ОМЧ – 10000-4000000.

Санитарно-микробиологическое состояние питьевой воды оценивается по общему микробному числу (ОМЧ) – количеству мезофильных факультативно-анаэробных микроорганизмов (МЕФАМ) в 1 мл воды; присутствию общих и термотолерантных колиформных бактерий.

По эпидемиологическим показаниям, в воде дополнительно определяют наличие энтерококков, сальмонелл, шигелл, вибрионов, энтеровирусов.

Определение общего числа микроорганизмов

Общее микробное число (ОМЧ) - общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов, способных образовывать колонии на питательном агаре при t=37 0 С в течение 24 часов, видимые с увеличением в 2 раза.

Из каждой пробы воды делают посев не менее двух объёмов по 1 мл. Для этого 1 мл воды вносят в стерильную чашку Петри, заливают 6-8 мл расплавленного и остуженного до 45-46 0 С питательного агара, тщательно перемешивают. После застывания агара чашки помещают вверх дном и инкубируют при 37 0 С в течение 24 часов. Затем подсчитывают все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Подсчитанное количество колоний на каждой чашке суммируют и делят на 2. Результат выражают в КОЕ (колониеобразующих единиц) в 1 мл исследованной пробы воды.

Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий

К общим колиформным бактериям относятся грамотрицательные, не образующие споры палочки, не обладающие оксидазной активностью ферментирующие лактозу или маннит с образованием альдегида, кислоты и газа при 37 0 С в течение 24 часов.

Термотолерантные колиформные бактерии обладают всеми признаками общих колиформных бактерий, но, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты и газа при 44 0 С в течение 24 часов.

(согласно СанПиНу 2.1.4.559–96)

Примечания: 1 – при определении проводится 2-кратное исследование по 100 мл отобранной пробы воды; 2 – превышение норматива не допускается в 95% проб, отбираемых в точках водоразбора наружной и внутренней водопроводной сети в течение 12 месяцев, при количестве исследуемых проб не менее 100 за год; 3 – определение проводится только в системах водоснабжения из поверхностных источников перед подачей воды в распределительную сеть; 4 – определение проводится только при оценке эффективности технологии обработки воды.

Метод мембранных фильтров

Мембранный фильтр помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая присоединяется к вакуумному насосу. Воду фильтруют в объёме 333 мл. Затем фильтры Зейтца помещают на поверхность среды Эндо в чашки Петри и после инкубации при 37 0 С в течение суток подсчитывают количество выросших колоний, типичных для БГКП. Из 2-3 колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonadaceae и других оксидазоположительных бактерий, обитающих в воде. Для этого фильтр с выросшими на нём колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной диметил-n-фенилендиамином. При наличии оксидазы индикатор окрашивает колонию в синий цвет. 2-3 колонии, не изменившие первоначальную окраску, засевают в полужидкую среду с 0,5% раствором глюкозы. Посевы инкубируют в течение суток при 37 0 С. При наличии газообразования подсчитывают число красных колоний на фильтре.

Бродильный метод

Засевают 3 объёма воды по 100 мл (для качественного анализа) или при исследовании воды с целью количественного определения общих колиформных бактерий делают посев 3 объёмов по 100 мл, 3 – по 10 мл и 3 – по 1 мл.

Посев 100 мл и 10 мл воды производят в 10 и 1 мл концентрированной лактозо-пептонной среды, посев 1 мл воды – в 10 мл среды обычной концентрации.

Посевы инкубируют при 37 0 C в течение 24-48 часов. Через 24 часа из питательной среды, где отмечено наличие роста и образование газа , делают высев по секторам на среду Эндо, приготовленную с добавлением фуксина.

Положительный результат на присутствие общих колиформных бактерий в данном объёме воды дают по помутнению и образованию газа на среде накопления (глюкозо-пептонная среда или лактозо-пептонная среда) и наличию красных колоний на среде Эндо. В сомнительных случаях выполняют оксидазный тест и подтверждают способность к газообразованию на среде с лактозой или маннитом (глюкозой).

Результат отрицательный , если

– в среде накопления нет признаков роста,

– на секторах среды Эндо нет роста лактозоположительных колоний,

– на секторах среды Эндо выросли нехарактерные для колиформных бактерий колонии,

– все колонии оказались оксидазоположительными,

– если в подтверждающем тесте на среде с лактозой или маннитом (глюкозой) не отмечено газообразования.

Наиболее вероятное число (НВЧ) бактерий (общих и термотолерантных колиформных бактерий) – вычисляют по специальным таблицам.

Санитарно-микробиологическое состояние воздуха закрытых помещений оценивают по общему микробному числу (ОМЧ) – количеству особей, обнаруживаемых в 1 м 3 воздуха, наличию санитарно-показательных бактерий: гемолитических стрептококков, золотистых стафилококков, а также дрожжевых и плесневых грибов.

Согласно СанПиН 2.1.3.1375-03, воздушная среда помещений лечебных учреждений и аптек по уровню бактериальной обсемененности разделена на 4 класса.

Микробиологические показатели для оценки воздушной среды аптечных учреждений можно определить путем посева воздуха седиментационным (по Коху) или аспирационным методом (в аппарате Кротова).

Допустимые уровни бактериальной обсеменённости воздушной среды помещений лечебных учреждений в зависимости от их
функционального назначения и класса чистоты

Класс чистоты	Название помещений	Санитарно-микробиологические показатели
общее количество микроорганизмов в 1 м 3 воздуха (КОЕ/м 3)	количество колоний S.aureus в 1 м 3 воздуха (КОЕ/м 3)	количество плесневых и дрожжевых грибов в 1 дм 3 воздуха
До начала	Во время работы	До начала	Во время работы	До начала	Во время работы
Особо чистые (А)	Операционные, родильный зал, асептические боксы для гематологических, ожоговых больных, палата для недоношенных, асептический блок аптек, стерилизационные (чистая половина) боксы бактериологических лабораторий	не более 200	не более 500	не должно быть	не должно быть	не должно быть	не должно быть
Чистые (Б)	Процедурные, перевязочные, предоперационные, палаты реанимации, залы реанимации, детские палаты, комнаты сбора и пастеризации грудного молока, ассистентские и фасовочные аптек, дистилляторная, помещения бактериологических и клинических лабораторий, предназначенные для исследований	не более 500	не более 750	не должно быть	не должно быть	не должно быть	не должно быть
Условно чистые (В)	Палаты хирургических отделений; коридоры, примыкающие к операционным и родильным залам; смотровые, боксы и палаты инфекционных отделений, ординаторские, материальные, кладовые чистого белья	не более 750	не более 1000	не должно быть	не более 2	не должно быть	не должно быть
Грязные (Г)	Коридоры и помещения административных зданий, лестницы, лечебно-диагностические, санитарные комнаты, туалеты, комнаты грязного белья	Не нормируются

Седиментационный метод (по Коху) – оседание микробов под действием силы тяжести - является простым способом изучения микрофлоры воздуха. Он заключается в том, что чашки Петри со средой оставляют открытыми на определённое время (5-10 минут на общую обсеменённость и не менее 40 минут на кокковую микрофлору), затем их закрывают, маркируют и выдерживают 24 часа в термостате и 24 часа при комнатной температуре. Количество выросших колоний соответствует степени загрязнённости воздуха: по приблизительному подсчёту на площадь 100 см 2 в течение 5 минут оседает столько микробов, сколько их содержится в 10 л воздуха.

Аспирационный метод – более точный количественный метод определения микробного числа воздуха. Посев воздуха осуществляется с помощью приборов. Аппарат Кротова устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью просасывается через узкую щель плексигласовой пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. При этом частицы аэрозоля с содержащимися на них микроорганизмами равномерно фиксируются на всей поверхности среды благодаря постоянному вращению чашки под входной щелью.

После инкубации посева в термостате проводят расчет микробного числа по формуле:

ОМЧ	=	N ∙ 1000
V

где N – количество выросших на чашке колоний;

V – объём пропущенного через прибор воздуха, дм 3 ;

1000 - искомый объём воздуха, дм 3 .

Наличие санитарно-показательных для воздуха микроорганизмов – золотистого стафилококка, гемолитического стрептококка, плесневых грибов, кандид – определяют по характеру выросших колоний на специальных средах (желточно-солевом агаре, кровяном агаре, среде Сабуро) и при микроскопическом изучении бактерий из этих колоний.

Контрольные вопросы

Каковы особенности ферментных систем бактерий? Как регулируется продукция ферментов у бактерий? Какие группы ферментов различают в зависимости от механизма, которым регулируется продукция фермента? Какое практическое значение имеет изучение ферментативной активности бактерий? Методы изучения сахаролитической и протеолитической активности бактерий. Дифференциально-диагностические среды: перечислите, назовите основные составные части и применение. На какое изменение среды реагирует индикатор в этих средах? По какому признаку дифференцируются бактерии на средах Эндо, Левина, Плоскирева? Каким свойством должны обладать бактерии, чтобы образовать на этих средах окрашенные колонии? Если бактерии образуют бесцветные колонии, что это означает? Среды Гисса их состав и применение. Что такое «пёстрый» или «цветной» ряд? Среда Олькеницкого, её состав; как производится посев и как отмечают на этой среде ферментацию разных углеводов, образование сероводорода? Что представляют собой микротест-системы для определения ферментативной активности микробов; как производят посев и как учитывают результаты? Что такое СИБ; как используется эта система, как производится посев и учёт результатов? Укажите основные объекты внешней среды, которые подвергаются санитарно-бактериологическому исследованию. Микробиоценоз, определение понятия. Перечислите и дайте характеристику межвидовых взаимоотношений в микробиоценозах. Какие показатели определяются при бактериологической оценке объектов внешней среды? Санитарно-показательные микроорганизмы: определение понятия. Какими свойствами должны обладать санитарно-показательные микроорганизмы? Перечислите санитарно-показательные микроорганизмы для воздуха, воды, почвы. Микрофлора воды: постоянная микрофлора, источники загрязнения. Показатели для санитарно-бактериологической оценки воды. Методика определения общего микробного числа воды. Показатели фекального загрязнения воды, методы их определения. Укажите предельно допустимые показатели для питьевой воды. Микрофлора воздуха: постоянная микрофлора, источники загрязнения. Показатели для санитарно-бактериологической оценки воздуха, методы их определения. Микрофлора почвы: постоянная микрофлора, её значение для круговорота веществ в природе. Источники загрязнения почвы патогенными микроорганизмами. Показатели для санитарно-бактериологической оценки. Для каких заболеваний факторами передачи могут быть вода, воздух, почва? Некультивируемые формы бактерий: определение понятия, практическое значение.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

Выпишите названия (по-латыни) видов санитарно-показательных микроорганизмов для воды, воздуха и почвы.

Самостоятельная работа студента на практическом занятии

1. Выделение чистой культуры бактерий–аэробов (3-й день). Изучите культуру на скошенном агаре макроскопически, приготовьте мазок, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте, сделайте вывод о чистоте культуры. Для дальнейшей идентификации выделенной культуры произведите посев на среды «пёстрого» ряда и на среду Олькеницкого. Изучите готовые посевы аэробных бактерий на средах «пёстрого» ряда и на среде Олькеницкого, составьте таблицу «Биохимическая активность микроорганизмов». Ознакомьтесь с методикой изучения ферментативной активности бактерий с помощью микротест-систем и СИБ.

2. Выделение чистой культуры анаэробов (4–й день). Изучите характер роста культуры на среде Китта–Тароцци, приготовьте мазок, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте.

3. Исследование микрофлоры воды и воздуха. Произведите посев водопроводной воды для определения общего микробного числа (ОМЧ). Определите показатели фекального загрязнения воды (наличие колиформных бактерий) по демонстрационным посевам и по таблице. Произведите посев воздуха лаборатории седиментационным методом и с помощью аппарата Кротова.

4. Методы изучения нормальной микрофлоры организма человека (подготовка к следующему занятию). Возьмите стерильным тампоном слизь из зева друг у друга и сделайте посев в пробирку с сахарным мясо-пептонным бульоном. Сделайте посев с кожи рук на чашку с МПА: возьмите маленький стерильный ватный тампон, смочите его в стерильном физиологическом растворе, протрите кожу, сделайте посев этим тампоном.

Дополнительный материал к занятию.

Санитарная микробиология – раздел медицинской микробиологии, изучающей микрофлору окружающей среды и ее влияние на здоровье человека. Санитарная микробиология разрабатывает методы контроля за состоянием воды, почвы, воздуха, пищевых продуктов и различных предметов обихода. Одновременно санитарная микробиология разрабатывает микробиологические нормативы и мероприятия по оздоровлению окружающей среды.

Практическая санитарная микробиология использует 2 основных метода оценки санитарно-эпидемиологического состояния внешней среды: прямое обнаружение патогенных микроорганизмов и выявление косвенных признаков пребывания патогенов во внешней среде.

Непосредственное обнаружение патогенных микроорганизмов, как правило, затруднено из-за их малого количества и проводится по эпидпоказаниям. Косвенные методы – это определениеобщей микробной обсеменённости илиобщего микробного числа (ОМЧ), а также определение и титрованиесанитарно-показательных микроорганизмов (СПМ), которые регулярно проводятся контролирующими органами с целью определения безопасности объектов для здоровья населения.

ОМЧ расценивается как показатель интенсивности загрязнения окружающей среды органическими веществами.

Санитарно-показательными называют микроорганизмы, по которым можно косвенно судить о возможном присутствии патогенов в окружающей среде.

Санитарно-показательные микроорганизмы
должны удовлетворять следующим характеристикам

1. Постоянно обитать в естественных полостях человека и животных и выделяться в окружающую среду.

2. Не должны размножаться вне организма, исключая пищевые продукты.

3. Длительность их выживания в окружающей среде должна быть не меньше и даже несколько больше, чем у патогенных микроорганизмов.

4. Устойчивость санитарно-показательных микроорганизмов в окружающей среде должна быть аналогичной или превышать таковую у патогенных микроорганизмов.

5. У санитарно-показательных микроорганизмов не должно быть в окружающей среде «двойников».

6. Микроб не должен изменяться в окружающей среде.

7. Методы индикации и идентификации санитарно-показательных микроорганизмов должны быть простыми.

Класс чистоты	Название помещений	Санитарно-микробиологические показатели
общее количество микроорганизмов в 1 м 3 воздуха (КОЕ/м 3)	количество колоний S.aureus в 1 м 3 воздуха (КОЕ/м 3)	количество плесневых и дрожжевых грибов в 1 дм 3 воздуха
До начала	Во время работы	До начала	Во время работы	До начала	Во время работы
Особо чистые(А)	Операционные, родильный зал, асептические боксы для гематологических, ожоговых больных, палата для недоношенных, асептический блок аптек, стерилизационные (чистая половина) боксы бактериологических лабораторий	не более200	не более500	не должно быть	не должно быть	не должно быть	не должно быть
Чистые(Б)	Процедурные, перевязочные, предоперационные, палаты реанимации, залы реанимации, детские палаты, комнаты сбора и пастеризации грудного молока, ассистентские и фасовочные аптек, дистилляторная,помещения бактериологических и клинических лабораторий, предназначенные для исследований	не более500	не более750	не должно быть	не должно быть	не должно быть	не должно быть
Условно чистые(В)	Палаты хирургических отделений; коридоры, примыкающие к операционным и родильным залам; смотровые, боксы и палаты инфекционных отделений, ординаторские, материальные, кладовые чистого белья	не более750	не более1000	не должно быть	не более2	не должно быть	не должно быть
Грязные (Г)	Коридоры и помещения административных зданий, лестницы, лечебно-диагностические, санитарные комнаты, туалеты, комнаты грязного белья	Не нормируются

После инкубации посева в термостате проводят расчет микробного числа по формуле:

ОМЧ	=	N ∙ 1000
V

где N – количество выросших на чашке колоний;

V – объём пропущенного через прибор воздуха, дм 3 ;

1000 - искомый объём воздуха, дм 3 .

Контрольные вопросы.

Каковы особенности ферментных систем бактерий? Виды ферментов: по их действию; по выделению в окружающую среду; конститутивные и адаптивные ферменты. Какое практическое значение имеет изучение ферментативной активности бактерий? Методы изучения протеолитической и сахаролитической активности бактерий. Дифференциально-диагностические среды: перечислите, назовите основные составные части и применение. На какое изменение среды реагирует индикатор в этих средах? По какому признаку дифференцируются бактерии на средах Эндо, Левина, Плоскирева? Каким свойством должны обладать бактерии, чтобы образовать на этих средах окрашенные колонии? Если бактерии образуют бесцветные колонии, что это значит? Среды Гисса, их состав и применение. Что такое «пёстрый» или «цветной» ряд? Среда Олькеницкого, как производится посев и как отмечают на этой среде ферментативные свойства бактерий? Методы определения протеолитической активности бактерий: разжижение желатина, образование индола, сероводорода, аммиака. Что представляют собой микротестсистемы для определения ферментативной активности бактерий: как производят посев и как учитывают результаты? Что такое СИБ, как используется эта система, как производится посев и учёт результатов?Микрофлора воздуха: какие микробы чаще всего встречаются, как меняется микрофлора в зависимости от условий. Что такое микробное число воздуха, какими методами оно определяется? Что такое санитарно-показательные микроорганизмы? Какие микробы считаются санитарно-показательными для воздуха? Какие патогенные микробы могут передаваться через воздух?Определите понятия: нормальная микрофлора организма человека; постоянная микрофлора; транзиторные микроорганизмы; потенциально опасные микроорганизмы. Назовите органы и ткани, свободные от постоянной микрофлоры. Какие микробы относятся к постоянной микрофлоре полости рта и какое значение имеют в норме и патологии? Характеристика микрофлоры различных областей организма: полости рта, желудочно-кишечного тракта, органов дыхания. Значение нормальной микрофлоры - положительное и отрицательное. Что такое дисбактериоз, в чём он выражается, причины его возникновения и способы предупреждения и устранения. Назовите препараты, применяемые для устранения дисбактериоза, что они содержат, как применяются, что с ними происходит в организме человека.

Задание на самостоятельную работу.

1. Выпишите названия (по-латыни) видов санитарно-показательных микроорганизмов для воздуха.

2. Напишите названия препаратов, применяемых для устранения дисбактериоза, их состав, применение.

Работа студента на практическом занятии.

1. Выделение чистой культуры бактерий - окончание (3 день). Посмотрите свои посевы предыдущего занятия, приготовьте мазки, окрасьте по Граму в модификации Синёва, промикроскопируйте, сделайте вывод о чистоте выделенной культуры.

2. Изучение ферментативной активности бактерий. Учет результатов определения ферментативной активности бактерий на средах Гисса с лактозой, глюкозой, маннитом, сахарозой и на среде Олькеницкого. (Демонстрация).

3. Ознакомьтесь с микро-тестсистемами, СИБ.

4. Приготовьте мазок из зубного налета: предметное стекло нанести бактериологической петлей каплю физиологического раствора. Стерильной заостренной деревянной палочкой возьмите у себя зубной налет, внесите в каплю. Приготовьте мазок после высушивания и фиксации окрасьте по Граму в модификации Синёва, микроскопируйте, зарисуйте. Сделайте вывод.

5.Исследование микрофлоры воздуха. Произведите посев воздуха в лаборатории седиментационным методоми с помощью аппарата Кротова.